Реферат роботи Представлена робота "Біомаркери інфекційних захворювань на прикладі туберкульозу та дифтерії"



Скачати 140.36 Kb.
Дата конвертації27.10.2017
Розмір140.36 Kb.
ТипРеферат

Реферат роботи


Представлена робота “Біомаркери інфекційних захворювань на прикладі туберкульозу та дифтерії” є циклом наукових праць, присвячених вищезазначеній темі.



Актуальність теми.

Останні століття минулого тисячоліття ознаменувалися перемогою над багатьма складними захворюваннями, серед яких поліомієліт, натуральна віспа, та ін. Нажаль, деякі захворювання досі становлять значну загрозу здоров’ю населення у світових масштабах. Від туберкульозу гине близько 2 мільйонів людей щорічно. Аналіз стану захищеності населення планети проти дифтерії свідчить про небезпеку повернення епідемії масштабу 1990 років, що відзначалася на теренах колишнього СРСР. Комплексність етіології цих захворювань суттєво ускладнює їх діагностику, профілактику і терапію.

Туберкульоз – інфекційне захворювання, що викликається Mycobacterium tuberculosis, і найчастіше вражає легені. В Україні, в зв’язку з недосконалістю методів боротьби з туберкульозом, захворюваність на це інфекційне захворювання почала невпинно зростати з 1990-го року. У 1995 році заявлено про епідемічну ситуацію стосовно туберкульозної інфекції. У подальшому, за період 1995-2004 років захворюваність зросла майже вдвічі: з 41,7 до 80,9 в перерахунку на 100 тис. населення (Фещенко, 2005). За даними ВООЗ зниження захворюваності відмічалося двічі – у 2002-му та у 2006-му роках, однак ці зниження носять, вірогідно, флуктуаційний характер. В будь якому разі, сьогодні захворюваність на туберкульоз в нашій країні залишається близькою до пікового рівня, досягнутого у 2006 році (станом на 2008р. - 78,08 на 100 000 населення). Крім того, Туберкульоз великої рогатої худоби (ВРХ), викликаний збудником Mycobacterium bovis, призводить до значних економічних збитків у сільському господарстві та становить небезпеку для здоров’я населення.

Інфікування мікобактеріями – складний, багатоманітний за фенотиповими проявами процес, що протікає в умовах постійної динамічної взаємодії патогену та імунної системи хазяїна (Casadevall & Pirofski, 2000). Дослідження молекулярних біомаркерів туберкульозу є надзвичайно актуальним завданням сучасної молекулярної епідеміології. Біомаркери можуть бути асоційовані з визначеною стадією захворювання, певним фізіологічним станом організму, можуть маркувати шлях відповіді на терапію, відмічати чутливість до певного впливу, тощо. Раціонально сформована сукупність специфічних біомаркерів здатна забезпечити своєчасну високоінформативну діагностику та контролювати терапію на всіх етапах лікування. Крім того, окремі біомаркери патологічних станів можуть мати вагоме прогностичне значення. В світлі загрозливої епідеміологічної ситуації, вивчення біомаркерів мікобактеріальних інфекцій та розробка діагностичних підходів з їх використанням є актуальним завданням.

Іншим бактеріальним захворюванням зі складним механізмом взаємодії патоген-хазяїн є дифтерія. Коринебактерія вражає верхні дихальні шляхи або, рідше, слизові носа та очей, при цьому досить тісно взаємодіє з клітинами епітелію, формує обструктивні фібринозні плівки, може спричинювати пошкодження міокарда та інших органів (Collier 1975; Chenal et al. 2002). Виділяють декілька антигенів, що характеризують Corynebacterium diphtheriae: антиген О, загальний для всіх Corynebacterium sp.(Lautrop 1950); антиген К, розрізняючи який можна визначити штам Corynebacterium (Moody & Jones 1963); та дифтерійний токсин, який закодований в геномі коринефага, що вражає бактерію C. diphtheriae (Brüssow et al. 2004). Інфекційний процес може розвиватися за декількома шляхами: носійство та активне протікання хвороби, що залежить від комплексу факторів (наявність tox-гену збудника, імунний стан хазяїна тощо); тут виявляються певні риси схожості з протіканням туберкульозної інфекції. Проте, на відміну від захворювання, що викликається M. tuberculosis, для інфекційного процесу, спричиненого C. diphtheriae, ген дифтерійного токсину та його білковий продукт є єдиними біомаркерами носійства дифтерії, які можливо виявляти генетичними або імунологічними методами (Komiya et al. 2000; Efstratiou et al. 2000). Лише наявність активного дифтерійного токсину в крові або біологічних рідинах організму вказує на протікання інфекційного процесу.

Незважаючи на досить високий ступінь розуміння патогенезу C. diphtheriae, причини деяких ускладнень на сьогодні не визначені: ураження нирок, міокарду, клітин нервової системи тощо (Collier 2001). Окрім того, недослідженими залишаються причини нечутливості деяких видів тварин до дії токсину (El Hage et al. 2008), механізм транслокації С-домену крізь біліпідний шар (Chenal et al. 2009), надзвичайна біологічна активність токсину (Yamaizumi et al. 1978). Дослідження вищезгаданих питань важливе не лише для більш глибокого розуміння патогенезу дифтерії, але й з практичної точки зору. Токсин – унікальна молекулярна машина, що специфічна до певного типу клітин, здатна регулювати процеси поглинання молекул та біосинтетичні процеси ураженої клітини. На основі дифтерійного токсину можуть бути створені імунотоксини (Foss 2000; Micoli et al. 2010; Su et al. 2009), спрямовані лише на певні типи пухлинних клітин; медичні засоби для цілеспрямованої доставки ліків всередину клітин (Wiedlocha et al. 1992; Khramtsov et al. 2008), біотехнологічні засоби для трансформації клітин нуклеотидними послідовностями (Uherek et al. 1998).


Метою роботи є дослідження біомаркерів туберкульозу та дифтерії, пошук шляхів їх використання для діагностики та вивчення етіології цих захворювань. Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:


  • Створити штами-продуценти білкових маркерів туберкульозу та дифтерії: антигенів Mycobacterium bovis/tuberculosis MPT63, MPT83, злитий білок MPT63-MPT83, нетоксичного флуоресцентного похідного дифтерійного токсину mCherry Rd, рекомбінантного аналога рецептора дифтерійного токсину – sHB-EGF людини. Розробити ефективну схему їх виділення та очистки.

  • Дослідити можливість використання антигенів Mycobacterium bovis/tuberculosis MPT63, MPT83, як біомаркерів туберкульозного процесу.

  • Розробити методологічні підходи для детекції рівня гуморальної відповіді проти MPT63, MPT83 та злитого білка MPT63-MPT83 з метою виявлення туберкульозної інфекції.

  • Дослідити можливість застосування флуоресцентних похідних дифтерійного токсину для моделювання процесів взаємодії токсину з клітинним рецептором proHB-EGF та дослідження внутрішньоклітинного транспорту комплексу токсин-рецептор.

  • Перевірити можливість використання рекомбінантного sHB-EGF людини для виявлення функціонально-активного дифтерійного токсину та рівня гуморальної відповіді до токсину.

Результати: Згідно з поставленими завданнями були отримані наступні результати:


1. Робота: Oliynyk O.S., Korzhov E.M., Kabemiuk A.A., Burkaleva D.A., Redchuk T.A., Romanyuk S.I., Kolibo D.V., Kostyukcvich E.V., Shirshov Yu.M., Ushenin Yu.V., Busol V.O., Komisarenko S.V. Development of immunosensor for express diagnosis of bovine tuberculosis // Investigations On Sensor Systems And Technologies – 2006., P. 74-86.
Роботу присвячено дослідженню взаємодії МРТ63 та МРТ83 з сироватками крові тварин, хворих на туберкульоз. За допомогою біосенсору, робота якого базується на використанні явища поверхневого плазмонного резонансу, продемонстровано безпосередню взаємодію антитіл з сироваток худоби, хворої на туберкульоз, з антигенами збудника туберкульозу МРТ63 та МРТ83.
2. Робота: Бусол В.О., Кабернюк А.А., Колибо Д.В., Олійник О.С., Постой В.П., Редчук Т.А., Романюк С.І., Шевчук В.М.. Значення клітинних і гуморальних імунних реакцій до антигенів Mycobacterium bovis у діагностиці туберкульозу великої рогатої худоби // Матеріали V міжнародного конгресу спеціалістів ветеринарної медицини. Національний аграрний університет, Київ, Україна. – 3-5 жовтня 2007., с. 87-91.
В роботі за допомогою імуно-ензимного аналізу досліджено рівень антитіл до антигенів мікобактерій МРТ63, МРТ83 та туберкуліну у сироватках крові ВРХ з стада, неблагополучного щодо туберкульозу. Обговорюються основні аспекти використання в якості біомаркерів туберкульозної інфекції гуморальної та клітинної імунної відповіді на антигени збудника.


3. Робота: Редчук Т.А., Олійник О.С., Кабернюк А.А., Буркальова Д.О., Романюк С.І., Колибо Д.В., Комісаренко С.В. Клонування та експресія білків Mycobacterium bovis MPB63 і MPB83 в клітинах Escherichia coli //Доповіді Національної академії наук України – 2007, № 9, с. 161-166.
Описано отримання рекомбінантних антигенів MPТ63 і MPТ83. Для цього були ампліфіковані фрагменти генів, що кодують білки MPТ63 і MPТ83, з геномної ДНК Mycobacterium bovis BCG. Створені рекомбінантні конструкції на основі плазмідного вектора pET24a, що несуть фрагменти генів mpb63 і mpb83. Експресію під контролем промотора фагу Т7 проводили в штамі E.coli Rosetta (DE3). Наявність продукту в лізаті клітин визначали шляхом іммуноблотингу. Продукти експресії фрагментів mpb63 і mpb83 (rMPB63 і rMPB83 відповідно) виділяли з лізату шляхом металоафінної хроматографії в денатурувальних умовах.
4. Робота: А. А. Кабернюк, А. Ю.Лабинцев, Д. В. Колибо, О. С. Олійник, Т. А. Редчук, Н. В. Короткевич, В. Ф. Горчев, С. О. Карахім, С. В. Комісаренко Флуоресцентні похідні субодиниці В дифтерійного токсину та взаємодія їх із клітинами лінії Vero // Українській біохімічний журнал. – 2009. – Т. 81, № 1 – С. 67-77.
Отримано штам-продуцент злитого рекомбінантного білка субодиниці В дифтерійного токсину з підсиленим зеленим флуоресцентним білком та хімічно кон’юговано рекомбінантну субодиницю В з флуоресцеїн ізотіоціанатом. Методами цитофлуориметрії та конфокальної мікроскопії було підтверджено специфічність взаємодії мічених похідних субодиниці В дифтерійного токсину з клітинами лінії Vero. За допомогою конкурентного аналізу було встановлено, що флуоресцентні похідні мали різну спорідненість до клітин, причому, ЕGFP-SbB мала вищу спорідненість ніж FITC-SbB. Результати свідчать про можливість використання отриманих флуоресцентних зондів для визначення експресії рецепторів дифтерійного токсину HB-EGF на клітинах, а також для вивчення особливостей взаємодії токсину з рецепторами клітин-мішеней.
5. Робота: Короткевич Н.В., Лабинцев А.Ю., Кабернюк А.А., Колибо Д.В., Комісаренко С.В. Цитотоксичність субодиниці В дифтерійного токсину на клітини гістоцитної лімфоми людини U937 // Укр. біохім. Журн. – 2009. 81, №. 4: 69-80.
Виявлено цитотоксичний ефект рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину (ДТ) щодо клітин гістоцитарної лімфоми людини U937. На основі отриманих даних висунуто припущення про те, що в основі цитотоксичного впливу субодиниці В ДТ лежить її здатність інгібувати біологічну активність гепарин-зв’язувального ростового фактору sHB-EGF.

6. Робота: Оптимізація умов синтезу кон’югатів протеїну А з колоїдним золотом та розробка підходів для їх характеристики / А.Ю. Лабинцев, О.С. Олійник, А.А. Кабернюк, О.Ю. Чуніхін, В.Ф. Горчев, Т.О. Курченко, В.І. Чернишов, Д.В. Колибо // Біотехнологія. – 2009. – Т.2, №. 2. – С. 76-83.
Оптимізовано метод отримання кон’югатів наночастинок золота з рекомбінантним фрагментом протеїну А Staphylococcus aureus для використання в імунохроматографічних тест-системах. Проаналізовано вплив основних компонентів реакційної суміші на розмір частинок золота та його кон’югатів з фрагментом протеїну А, їхню гомогенність, стабільність та ефективність розпізнавання імуноглобулінів. Запропоновано методи для швидкого визначення розмірів синтезованих наночастинок золота з використанням оптичних характеристик. На основі одержаних результатів висунуто рекомендації щодо отримання кон’югатів наночастинок золота з фрагментом стафілококового протеїну А, які можна застосовувати у швидких іммунохроматографічних тест-системах.
7. Робота: Короткевич, Н.В., Колибо, Д.В., Лабинцев, А.Ю., Романюк, С.І., Комісаренко, С.В. Отримання рекомбінантного аналога секреторної форми HB-EGF людини та оцінка перспектив його застосування в біотехнології // Біотехнологія – 2010. 3, №.4: 45-55.
Отримано біологічно активний рекомбінантний аналог гепарин-зв’язувального ростового фактору людини sHB-EGF. Показано можливість його використання у непрямому імуноферментному аналізі для визначення біологічно активного дифтерійного токсину.
8. Робота: Лабинцев А.Ю., Короткевич Н.В., Кабернюк А.А., Романюк С.І., Колибо Д.В., Комісаренко С.В. Взаємодія субодиниці В дифтерійного токсину з клітинами чутливих та нечутливих до токсину видів ссавців. // Укр. біохім. журн. – 2010. 82, №. 6: 65-75.
Показано, що протеїн EGFP-SbB здатний взаємодіяти з рецепторами як чутливих до дифтерійного до токсину клітин мавпи (лінії Vero), так і нечутливих клітин миші (лінії 3Т3). Продемонстровано втричі вищу спорідненість цього протеїну до клітин лінії Vero порівняно з клітинами лінії 3Т3. Виявлено здатність такого флуоресцентного похідного не лише взаємодіяти з рецепторами обох ліній клітин, але й проникати всередину цих клітин. Отримані дані вказують на те, що відмінності у чутливості клітин мишей і приматів до ДТ, можуть бути обумовлені не лише різною спорідненістю токсину до їх рецепторів, але й процесами, що відбуваються після проникнення токсину всередину клітини.

9. Робота Redchuk T.A., Korotkevich N.V., Kaberniuk A.A., Oliinyk E.S., Labyntsev A.Y., Romaniuk S.I., Kolibo D.V., Komisarenko S.V. Statistical analysis of the distribution of the antibody levels to Mycobacterium bovis antigenes for bovine tuberculosis diagnostics. // Cytology and Genetics, 2010. 44(5), 280-285.
У роботі були визначені рівні антитіл проти рекомбінантних аналогів антигенів Mycobacterium bovis rMPB63 та rMPB83, а також проти деривату туберкуліна PPD в 94 зразках сироваток крові ВРХ. Запропонована схема статистичного аналізу розподілу рівня антитіл до досліджених антигенів за допомогою апроксимації сукупністю кривих Гауса за алгоритмом Левенберга-Маркуардта. Наведені результати вказують на можливість використання рівня гуморальної імунної відповіді до рекомбінантних антигенів MPB63 та MPB83 як біомаркеру туберкульозного статусу окремої популяції тварин (на рівні групи).
10. Робота: Редчук Т.А, Короткевич Н.В., Кабернюк А.А., Олійник О.С., Лабинцев А.Ю., Романюк С.І., Колибо Д.В., Комісаренко С.В. Рекомбінантний химерний протеїн MPB63–MPB83 — перспективний антиген для діагностики туберкульозу // Біотехнологія – 2010, Т.3, №5, С. 50-56.
Шляхом об’єднання послідовностей генів mpb63 та mpb83 M. bovis отримано химерний протеїн MPB63-MPB83. Дослідження антигенних властивостей отриманого рекомбінантного протеїну в експериментах з використанням сироваток кролів, імунізованих антигенами MPB63 і MPB83, показали не лише відповідність антигенної структури злитого протеїну та його складових частин, а і можливість досягти більш високого рівня сигналу в ІФА з використанням химерної конструкції. Також був визначений рівень антитіл проти злитого протеїну MPB63-MPB83 в сироватках крові умовно здорових, імунізованих вакциною БЦЖ, експериментально заражених різними видами мікобактерій (M. bovis, М. intracellulare, М. scrofulaceum, М. fortuitum) та хворих на лейкоз корів. Результати цих експериментів показали, що високий рівень антитіл проти злитого протеїну MPB63-MPB83 спостерігався лише у тварин, заражених M. bovis.
Висновки:


  1. Одержано рекомбінантні аналоги перспективних білкових маркерів туберкульозу та дифтерії: антигени Mycobacterium bovis/tuberculosis MPT63, MPT83, злитий білок MPT63-MPT83, нетоксичне флуоресцентне похідне дифтерійного токсину mCherry Rd, рекомбінантний аналог рецептора дифтерійного токсину – sHB-EGF людини. Розроблено ефективну схему їх виділення з клітин E. coli, очищення з використанням металоафінної хроматографії та рефолдингу.




  1. Показано, що рівень гуморальної імунної відповіді до протеїнів Mycobacterium bovis/tuberculosis MPT63 та MPT83 є біомаркером туберкульозного процесу. Розподіл рівня гуморальної імунної відповіді до цих антигенів є асиметричним у неоднорідній щодо туберкульозного статусу популяції. Рівень гуморальної імунної відповіді до MPT63 та MPT83 був значно вищим у тварин, інфікованих патогенними мікобактеріями порівняно з непатогенними.




  1. Запропоновано методологічні підходи до детекції рівня гуморальної відповіді проти MPT63, MPT83 та злитого білка MPT63-MPT83 на основі імуноферментного аналізу та імунохроматографії.




  1. Встановлено можливість застосування флуоресцентних похідних дифтерійного токсину для моделювання процесів взаємодії токсину з клітинним рецептором proHB-EGF та дослідження внутрішньоклітинного транспорту комплексу токсин-рецептор. Виявлено, що флуоресцентні похідні дифтерійного токсину здатні зв’язуватись з рецептором та проникати всередину клітин нечутливих до токсину організмів, а отже причини їх нечутливості обумовлені не лише різною спорідненістю токсину до їхніх рецепторів, але й процесами, що відбуваються після проникнення токсину всередину клітини.



  1. Запропоновано використання рекомбінантного sHB-EGF людини для детектування функціонально-активного дифтерійного токсину у форматі непрямого імуноферментного аналізу та рівня протективних антитіл у форматі конкурентного імуноферментного аналізу.


Наукова новизна одержаних результатів

Отримано штами Escherichia coli – продуценти рекомбінантних антигенів Mycobacterium bovis/tuberculosis MPT63, MPT83, нетоксичного флуоресцентного похідного дифтерійного токсину Corynebacterium diphtheriae – mCherry Rd, розчинної форми рецептора дифтерійного токсину – гепарин-зв’язувального фактору росту людини sHB-EGF. Отримані штами продуценти призначені для отримання зазначених рекомбінантних білків, які можуть бути використані для вирішення широкого спектру задач.

Нами вперше досліджений статистичний розподіл рівня антитіл проти антигенів збудника туберкульозу МРТ63 та МРТ83 у неоднорідній за туберкульозним статусом популяції тварин. Виявлено, що розподіл рівня гуморальної імунної відповіді до цих антигенів є асиметричним. Отримані дані дозволили запропонувати використання очищених рекомбінантних білків збудника туберкульозу в якості антигенів для діагностики туберкульозу великої рогатої худоби на рівні стад. Також розроблено новий підхід до напівкількісного визначення кількості антитіл до зазначених антигенів у сироватках за допомогою імунохроматографії.

Вперше отримано химерний білок, що містить послідовності MPT63 та MPT83, запропоновано ефективну схему його очистки та рефолдингу. Виявлено, що рівень гуморальної імунної відповіді до MPT63 та MPT83 є значно вищим у тварин, інфікованих патогенними мікобактеріями порівняно з непатогенними. Продемонстровано переваги використання злитого протеїну в порівнянні з окремими протеїнами.

Вперше запропоновано використання нетоксичних флуоресцентних похідних дифтерійного токсину для моделювання взаємодії дифтерійного токсину з природним рецептором proHB-EGF та для дослідження внутрішньоклітинного транспорту комплексу токсин-рецептор. Показано, що особливості взаємодії токсину з рецептором нечутливих до дифтерійного токсину клітин не заважають проникати токсину, у складі ендосом, всередину таких клітин.

Вперше показано вплив Т-домену дифтерійного токсину на внутрішньоклітинний транспорт комплексу токсин-рецептор.

Вперше запропоновано використання рекомбінантного sHB-EGF людини для виявлення функціонально-активного дифтерійного токсину у форматі непрямого імуноферментного аналізу та рівня протективних антитіл у форматі конкурентного імуноферментного аналізу.
Практичне значення одержаних результатів.

Отримані в роботі рекомбінантні аналоги антигенів Mycobacterium bovis/tuberculosis можуть бути використані у розробці протитуберкульозних тест-систем та субодиничних вакцин. Показано можливість створення на їх основі тест-систем як для дослідження протитуберкульозного імунітету на рівні популяцій, так і для індивідуальної діагностики. Високоспецифічні тест-системи на основі імуноензимного аналізу, поряд з туберкулінодіагностикою, могли б значно підвищити ефективність діагностування туберкульозу.

Досліджені біомаркери можуть бути використані в рамках запропонованих діагностичних схем разом з іншими біомаркерами мікобактеріальних інфекцій. Отримані антигени також можуть бути використані при розробці високоспецифічних шкірних тестів та тестів на вивільнення інтерферону.

Експресія МРТ63 та МРТ83, а також розвиток імунної відповіді до цих антигенів є високоінформативними маркерами туберкульозної інфекції, тому рекомбінантні МРТ63 і МРТ83 є корисними інструментами у етіологічних та молекулярно-епідеміологічних дослідженнях.

Дослідження механізмів функціонування дифтерійного токсину важливе не лише для більш глибокого розуміння патогенезу дифтерії, але й для створення перспективних лікарських і біотехнологічних препаратів на основі цієї унікальної транспортної молекули. В результаті даної роботи отримано дані щодо особливостей взаємодії дифтерійного токсину з клітинами чутливих і нечутливих до токсину видів тварин. Показано факт впливу Т-домену дифтерійного токсину на внутрішньоклітинний транспорт комплексу токсин-рецептор. Отримані результати відкривають нові горизонти для використання фрагментів дифтерійного токсину, як молекули для дослідження особливостей ендосомального транспорту.

Оскільки не лише мембранно-заякорена форма рецептору (proHB-EGF), але і його секреторний аналог (sHB-EGF) володіють здатністю зв’язувати дифтерійний токсин, нами було запропоновано використовувати отриманий рекомбінантний sHB-EGF як основний компонент імуноферментної тест-системи для виявлення біологічно активного дифтерійного токсину та протективних антитіл. Існуючі дифтерійні діагностикуми та тест-системи спрямовані на визначення загальної кількості антитіл проти дифтерійного токсину, натомість розроблений нами підхід із використанням рекомбінантного sHB-EGF дозволяє визначати рівень антитіл, які забезпечують стійкість організму до збудника. Також, використання рекомбінантного sHB-EGF дозволяє визначати наявність біологічно активних молекул дифтерійного токсину, виходячи із його здатності зв’язуватися із рецептором. Використання розробленого підходу може виявитися незамінним при дослідженні особливостей протікання інфекційного процесу.

Отриманий у ході виконання представленої роботи рекомбінантний аналог гепарин-зв’язувального фактору росту людини sHB-EGF володіє широким спектром біологічних активностей. Так, sHB-EGF людини посилює проліферацію та міграцію клітин фібробластів у культурі в зв’язку з чим може бути використаний для створення ліків нового покоління для підвищення проліферативного потенціалу тканин, як за фізіологічних пошкоджень (рани, подряпини, післяопераційні ускладнення) так і за патологічних станів (діабетична стопа, виразки).
Загальна кількість публікацій. Цикл робіт включає 10 статей (з них 3 в «Українському біохімічному журналі», 3 в журналі «Біотехнологія», 1 – «Cytology and Genetics», 1 – «Доповіді Національної академії наук України», 1 – в складі монографії «Investigations On Sensor Systems And Technologies», 1 – «Матеріали V міжнародного конгресу спеціалістів ветеринарної медицини»), 17 тез доповідей українських та міжнародних конференцій.

Виконавці:

к.б.н., н.с. Т.А. Редчук

асп. Н.В. Короткевич

асп. А.Ю. Лабинцев

Вчений секретар,



к.б.н. З.С. Протасова

Поділіться з Вашими друзьями:


База даних захищена авторським правом ©wishenko.org 2017
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка