«отримання фармацевтично-цінних білків в рослинах та вивчення стійкості трансгенних рослин до фітопатогенних вірусів»



Скачати 115.91 Kb.
Дата конвертації23.10.2017
Розмір115.91 Kb.
ТипРеферат

РЕФЕРАТ

роботи Сіндаровської Я.Р., Василенко М.Ю., Лозової О.Й., Демченко О.А. на тему «ОТРИМАННЯ ФАРМАЦЕВТИЧНО-ЦІННИХ БІЛКІВ В РОСЛИНАХ ТА ВИВЧЕННЯ СТІЙКОСТІ ТРАНСГЕННИХ РОСЛИН ДО ФІТОПАТОГЕННИХ ВІРУСІВ»
З появою технологій рекомбінантних ДНК з’явилась можливість отримувати фармацевтично-цінні білки генно-інженерним способом у строго контрольованих умовах та в промислових об’ємах, в результаті чого величезна кількість людей була забезпечена важливими для здоров’я білковими препаратами (інсуліном, інтерфероном, еритропоетином тощо).

На сьогоднішній день бактерії та культури клітин ссавців є найбільш усталеними системами для продукції білкових препаратів. Проте обидві системи не досконалі і мають свої значні недоліки. У зв’язку з цим ведеться пошук альтернативних експресійних систем для продукції цільових білків.

Рослини потенційно є найбільш економічними та безпечними системами для масштабної продукції білків. Припускають, що вартість цільових білків, отриманих в рослинах, буде принаймні в 10 разів нижчою ніж в існуючих системах. Вирощування рослин не вимагає дорогого обладнання та культуральних середовищ. Рослини не містять тваринних вірусів та бактерій, пріонів, онкогенних послідовностей, бактеріальних токсинів. В рослинній клітині можуть відбуватись посттрансляційні модифікації, властиві тваринним білкам. В деяких випадках можливе використання цільового білка без попереднього його виділення із рослинної сировини («їстівні вакцини»). Створення «їстівних вакцин» зменшить вартість вакцинних препаратів, полегшить процедуру вакцинації і зменшить небезпеку потрапляння в організм людини патогенів, що переносяться через кров.

Слід наголосити і на труднощах, що існують при одержанні цільових білків в рослинах. Одна з проблем стосується все ще низьких рівнів накопичення білків. Тому, незважаючи на успіхи, ще й досі на світовому ринку немає жодного рекомбінантного препарату, отриманого з рослин.

Серед інших, одним із можливих шляхів підвищення вмісту цільових білків у рослинах є використання методу транзієнтної експресії генів. Транзієнтна експресія («transient» – тимчасовий) генів проходить без інтеграції чужорідної ДНК в геном. Цільовий ген потрапляє в клітину, де експресується певний час, далі - чужорідна ДНК деградується або піддається сайленсингу. В такий спосіб можна вже через кілька днів накопичити значну кількість цільових білків (до 80% від загального вмісту білків). Метод дозволяє отримувати також складні білкові комплекси, такі як антитіла, що особливо важливо при лікуванні онкологічних хвороб зі швидким розвитком або при лікуванні сезонних епідемій. Такий метод є досить привабливим для накопичення білків проте ще й досі мало відомо про фактори біотичної та абіотичної природи, які можуть суттєво впливати на вміст цільових білків при транзієнтному накопиченні генів.

Іншим підходом для підвищення вмісту цільових білків є створення транспластомних рослин. Чужорідна ДНК потрапляє в рослинний геном пластид (пластом), де відбувається постійна (стабільна) експресія цільового гена. Даний тип інтеграції дозволяє досягати багатокопійності перенесеного гена, а також уникати позиційних ефектів, в результаті чого вміст цільових білків може перевищувати 20% від загального вмісту білків. Не дивлячись на всю привабливість методу, пластидна трансформація вищих рослин залишається складною проблемою і вимагає створення нових підходів для її вирішення.

При накопиченні цільових білків виникає ризик зараження трансгенних рослин фітопатогенами, що може позначитись і на рівнях кінцевої бажаної продукції. Отже, існує необхідність детального і всебічного вивчення впливу збудників рослинних хвороб не лише на саму рослину, її урожайність, товарний вигляд тощо, але й на вміст чужорідних білків.

У зв’язку з цим метою нашої роботи було розроблення перспективних підходів для підвищення кінцевого вмісту цільових (чужорідних) білків та створення платформи для подальшого накопичення фармацевтично-цінних білків у рослинах у великих кількостях;а також вивчення впливу фітопатогенів на продукцію цільових білків у трансгенних рослинах.

Для вирішення даної проблеми були поставлені наступні завдання:

- розробити методику ефективного перенесення пластид видів рослин з низьким регенераційним потенціалом до цитоплазми рослин з високим регенераційним потенціалом для подальшого отримання транспластомних рослин з цільовими генами;

- підібрати умови для регенерації трансгенних рослин в умовах in vitro;

- створити нові удосконалені генетичні векторні конструкції, що містять гени фармацевтично-цінних білків;

- розробити методику швидкого молекулярно-біологічного аналізу трансгенних рослин шляхом одночасного тестування на наявність/відсутність кількох генів/ трансгенів (розробити методику мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції);

- підібрати умови для тимчасового (транзієнтного) накопичення цільових білків у рослинах шляхом визначення факторів, які найсильніше впливають на коливання вмісту білка;

- визначити вплив вірусної інфекції на вміст цільових білків в трансгенних рослинах та визначити можливість пригнічення репродукції вірусів у трансгенних рослинах;

- провести детальне і всебічне вивчення патогенного і шкідливого для культурних рослин мінус РНК-геномного рабдовірусу, поширеного на Україні, – вірусу опіку гречки (ВОГ).



Наукова новизна роботи. Вперше був застосований метод пролонгованої селекції на спектиноміцині для індукування стабільного альбінізму (недостатність пластидних рибосом) рослин без використання мутагенних речовин, з метою утворення партнерської клітинної лінії для соматичної гібридизації. Такий метод дозволив прискорити процес утворення як самих «альбіно»- (хлорофіл-дефектних) ліній рослин, так і власне цибридних рослин, тобто рослин, які несуть пластиди одного виду, а ядро та інші компоненти цитоплазми іншого виду рослин. Важливо, що після утворення стабільної «альбіно»- лінії, вона може в подальшому підтримання на середовищі без додавання селективного антибіотику (спектиноміцину). Для створення аналогічних хлорофіл-дефектних ліній рослин зазвичай використовують мутагени, тому застосування спектиноміцину є альтернативним варіантом.

Були створені нові генетичні конструкції, що містять гени антигенних детермінант ESAT6 та Ag85B туберкульозної палички (Mycobacterium tuberculosis) для ядерної та пластомної трансформації клітин рослин, а також вектори для трансформації рослин, які містять химерні послідовності генів fbpB::gfp та fbpB(ΔTMD)::gfp. Поєднання туберкульозного антигену Ag85B та його варіанту Ag85B(ΔTMD) з маркерним білком GFP дало змогу виявити експресію деяких кількостей цільового білку в клітинах Nicotiana benthamiana за умов транзієнтної експресії, частково локалізувати місця його накопичення та порівняти із експресією власне GFP. Також отримано ряд стабільно трансформованих ліній N .tabacum та N .benthamiana, методом ПЛР-детекції доведено присутність трансгенів в даних лініях.

Вперше в Україні було розроблено методику швидкого молекулярно-біологічного аналізу трансгенних рослин шляхом одночасного тестування на наявність/відсутність кількох генів/ трансгенів (метод мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції) (Патент України 51842).

Вперше в Україні (і одночасно з розробкою даного методу в інших передових наукових лабораторіях світу) був застосований метод транзієнтної експресії генів для отримання цільових білків в рослинах. Було проведено системне дослідження факторів абіотичної та біотичної природи, які можуть впливати на рівень накопичення цільових білків при транзієнтній експресії генів. Такий статистично оброблений системний аналіз раніше не проводився і закордонними вченими. Даний метод був застосований і для отримання фармацевтичних білків людини – лейкоцитарного інтерферону та гормону росту (соматотропіну).

Вперше проведено відбір нових видів-продуцентів, серед представників роду Nicotiana, перспективних для отримання цільових білків шляхом транзієнтної експресії з використанням різних типів векторних систем. Вперше показано, що вид N. excelsior має кращі показники, ніж модельні види N. benthamiana та N. tabacum для накопичення цільових білків при транзієнтній експресії (Патент України 31239). Вперше показано транзієнтну експресію гена цільового білка під контролем 35S промотору вірусу мозаїки цвітної капусти у видах N. cavicola та N. exigua і встановлено, що рівень накопичення цільового білка в них не менший ніж у модельних видах.

Вперше отримано культуру бородатих коренів N. benthamiana та розроблено систему регенерації рослин із трансгенних коренів для покращення біотехнологічних характеристик виду.

Вперше доведено вплив стадії розвитку рослини та віку листків рослини на накопичення цільового білка при транзієнтній експресії гена. Також доведено вплив вірусного супресора сайленсингу генів р19 на накопичення цільового білка при транзієнтній експресії в гена у складі високоефективної рекомбіназної векторної системи. Вперше показано відсутність впливу екзогенних речовин - фітогормонів (ауксинів і цитокінинів), метилжасмонату та супресорів його біосинтезу - на накопичення цільового білка при транзієнтній експресії.

Особливий інтерес представляє дослідження впливу фітопатогенів на вміст цільових білків. У зв’язку з цим, було проведене вивчення одного з шкодочинних вірусів, поширених на території України, мінус-РНК-геномного фіторабдовірусу - вірусу опіку гречки (ВОГ). В тому числі, вивчався вплив даного вірусу на накопичення цільового білка (інтерферону людини) в рослинах та, навпаки, вплив цільових білків на розповсюдження вірусної інфекції в трансгенних рослинах.

Показано, що трансгенні рослини, що експресують гени секреторних ендонуклеаз, характеризуються не лише суттєвою затримкою накопичення вірусу опіку гречки, але і затримкою появи симптомів інфекції в порівнянні з нетрансгенними контрольними лініями. Також було продемонстровано можливість затримки розвитку вірусної інфекції при інфікуванні вірусом тютюнової мозаїки (плюс-РНК геномний вірус) трансгенних рослин, які експресують ген альфа інтерферону людини.

З іншого боку, було показано, що мінус-РНК геномний вірус опіку гречки здатний пригнічувати накопичення альфа інтерферону людини в трансгениих рослинах. Збільшення вірусу в рослинній тканині корелювало зі зменшенням активності інтерферону.

Дослідження ВОГ показало, що вірус має всі структурні особливості характерні для родини Rhabdoviridae, він патогенний для цінних сільськогосподарських культур серед яких гречка, картопля, тютюн, томати, перець тощо. Вперше було показано, що даний вірус, як і віруси тварин даної родини, має аглютинуючі властивості. Доведено здатність ВОГ до індукції синтезу гама-інтерферону у периферичних клітинах крові та піднебінних мигдалинах людини. Вперше продемонстровано, що ВОГ здатний запускати апоптоз в злоякісних клітинах Саркоми 37.

Практичне значення одержаних результатів. Метод соматичної гібридизації та створення цибридних рослин (з пластидами одного виду рослин, а ядром та рештою органел іншого виду) - це один зі шляхів вирішення складної генно-інженерної проблеми, а саме отримання вищих рослин з модифікованим пластомом. У такий спосіб використовується регенераційний потенціал одного виду рослин (наприклад, модельного виду тютюну або дикого представника роду Brassicaceae), а фармацевтично-цінні гени знаходяться в пластидах культурного/ іншого виду. Це дозволяє розширити видове різноманіття для генетичних маніпуляцій і створювати унікальні гібридні продукти. Підбирання і створення партнерів для отримання цибридних ліній рослин є ключовим фактором для процесу гібридизації. Власні пластиди виду-репицієнту здатні витісняти привнесені пластиди виду-донору, отже для отримання цибридних рослин, які не будуть повертатись до рослин дикого типу, необхідно надійне закріплення ознаки альбінізму (хлорофіл-дефектності) в клітинах виду-реципієнту. Такою надійністю наділені «альбіно»- лінії, створені шляхом тривалої селекції на спектиноміцині. Важливе значення для створення трансгенних рослин є вдалий підбір поживних середовищ для регенерації повноцінних рослин з пулу трансформованих клітин.

Створення нових удосконалених генетичних конструкцій є важливим елементом при отриманні фармацевтичних білків. Таким способом можна підвищити рівень накопичення цільових білків на кілька порядків, а також зберегти їх від руйнування, модифікувавши білок або спрямувавши його в певний компартмент клітини. Так, було створено ряд генетичних конструкцій для стабільної трансформації рослин (ядра та пластома) генами антигенних детермінант ESAT6 та Ag85B туберкульозної палички. Згадані антигени розглядаються в світі як нові претенденти для створення субодиничних вакцинних препаратів проти туберкульозу. При чому існує можливість не лише отримувати очищені туберкульозні білки, але й уникати дорогої процедури очищення, накопичивши цільовий білок у їстівних рослинах і створивши таким чином «їстівні протитуберкульозні вакцини». Зроблені генетичні конструкції вже були використані для отримання деяких трансгенних рослин (салат-латук, цикорій салатний). Проведена робота є частиною великого дослідження щодо експресії та накопичення туберкульозних антигенів в рослинних клітинах, результати цієї роботи мають бути продовжені і розвинуті в наступних дослідженнях для з’ясування можливостей ефективної продукції антигенів в рослинних системах.

Отже, в процесі виконання даної роботи було створено вектори для трансформації рослин, які містять химерні послідовності генів fbpB::gfp та fbpB(ΔTMD)::gfp. Поєднання туберкульозного антигену Ag85B та його варіанту Ag85B(ΔTMD) з маркерним білком GFP дало змогу виявити експресію деяких кількостей цільового білку в клітинах N.benthamiana за умов транзієнтної експресії, частково локалізувати місця його накопичення та порівняти із експресією власне GFP. Також отримано ряд стабільно трансформованих ліній N.tabacum та N.benthamiana, методом ПЛР-детекції доведено присутність трансгенів в даних лініях. Проведена робота є частиною великого дослідження щодо експресії та накопичення туберкульозних антигенів в рослинних клітинах, результати цієї роботи мають бути продовжені і розвинуті в наступних дослідженнях для з’ясування можливостей ефективної продукції антигенів в рослинних системах

Швидкий молекулярно-біологічний аналіз трансгенних рослин шляхом одночасного тестування на наявність/відсутність кількох генів/ трансгенів (метод мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції - ПЛР) дозволяє значно економити час (від двох до п’яти разів в залежності від кількості генів, які одночасно виявляють) та зусилля, необхідні для підтвердження трансгенності та чистоти ліній. Додатково, застосування мультиплексної ПЛР дозволяє економити дорогі реактиви.

Запропонований нами протокол підвищення вмісту цільових білків у рослинах шляхом підбору оптимальних умов для транзієнтної експресії генів є достатньо простим, широкодоступним та не вимагає значних витрат часу та коштів, а також має можливості для подальшого удосконалення. Продемонстровано можливість отримання цільових білків шляхом транзієнтної експресії генів в нових видах-продуцентах – Nicotiana. excelsior, N. cavicola та N. exigua. Вміст цільового білка в рослинах цих видів був не менший, або навіть вищий, ніж вміст цільового білка в модельних видах N. benthamiana та N. tabacum. Оскільки саме N. benthamiana та N. tabacum часто використовуються для отримання фармацевтично-цінних білків методом транзієнтної експресії, застосування нових видів-продуцентів може підвищити кінцевий вміст цільового білка при використанні тих самих генетичних конструкцій. Додатково підвищити кількість цільового білка дозволить вибір оптимальної для транзієнтної експресії стадії розвитку рослини, а також інфільтрація найбільш придатних листків. Це дозволить збільшити не лише масовий, але й відсотковий, вміст у рослинному білковому екстракті цільового продукту, що в результаті полегшить процедуру очистки, а отже, зменшить собівартість цільового білка. Отримані дані про позитивний вплив супресора сайленсингу генів р19 на накопичення цільового білка, ген якого знаходився у складі рекомбіназної векторної системи, можуть бути використані для підвищення рівня накопичення інших білків, в тому числі і фармакологічно-цінних, гени яких входять до складу такої ж системи експресії. Було показано, що в рослинах нового виду-продуцента N. excelsior можна отримати лейкоцитарний інтерферон 2b та гормон росту людини, які мали біологічну активність. Таким чином, даний спосіб може бути розглянутий як альтернатива "класичному" мікробіологічному способу отримання фармацевтичних білків.

Здатність трансгенних рослини, з чужорідними генами секреторних ендонуклеаз або геном інтерферону, затримувати накопичення вірусу та розвиток вірусної інфекції може бути використана при розробці нових методів боротьби з фітовірусами.

З іншого боку, знання про здатність ВОГ пригнічувати накопичення альфа інтерферону людини в трансгениих рослинах може бути вкрай корисною інформацією для промислового отримання фармацевтичних білків.

Вивчення властивостей ВОГ відкриває широкі перспективи для його використання в медицині. Так, здатність запускати синтез інтерферону в клітинах людини представляє неабиякий інтерес до ВОГ як до можливого кандидата в індуктори інтерферону, який не являє загрози для теплокровних тварин. Важливим фактом є здатність ВОГ індукувати апоптоз злоякісних клітин тварин. Отримані дані відкривають можливості для використання цього вірусу у фітотерапії онкологічних захворювань.



За результатами проведених досліджень було опубліковано 62 наукових робіт, серед них глава у книзі Methods in Molecular Biology (закордонного видання Humana Press Inc.), 28 наукових статей (9- у міжнародних наукових журналах, які мають impact factor (ненульовий індекс цитування) та містяться в базі даних SCOPUS), 31 тез доповідей на наукових конференціях. Наукові розробки підтверджені 2 патентами України.

Поділіться з Вашими друзьями:


База даних захищена авторським правом ©wishenko.org 2017
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка